摘要：美國白蛾(Hyphantria cunea)是桑樹的重要害蟲。為明確蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲晶體蛋白對該蟲的作用機制,利用已知昆蟲氨肽酶N基因序列設(shè)計引物,以美國白蛾中腸cDNA為模板,利用RACE-PCR技術(shù)獲得美國白蛾中腸氨肽酶N基因hcapn1全長序列(GenBank登錄號:KP053647)。該基因開放閱讀框為3000bp,編碼999個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點分別為113.14kD和4.85。設(shè)計去信號肽引物PCR擴增獲得hcapn1基因序列,構(gòu)建原核重組表達載體pET30a-hcapn1,誘導(dǎo)表達的HcAPN1重組蛋白約110kD。將蘇云金桿菌Cry1Ac、Cry2Ab33和Cry9Ea6原毒素經(jīng)胰蛋白酶消化后與HcAPN1重組蛋白分別進行體外配體印跡試驗,發(fā)現(xiàn)HcAPN1重組蛋白與Cry9Ea6結(jié)合,而不與Cry2Ab33、Cry1Ac發(fā)生特異結(jié)合,推測HcAPN1可能為Cry9Ea6在美國白蛾中腸的受體蛋白。分別設(shè)計引物擴增HcAPN1蛋白2個結(jié)構(gòu)域Asp34~Asp 527和Leu563~Gln925的編碼序列,在大腸埃希菌中表達獲得62kD和48kD 2種重組蛋白,體外結(jié)合試驗顯示Cry9Ea6與HcAPN1的結(jié)合發(fā)生在Leu563~Gln925之間。研究結(jié)果為深入理解蘇云金桿菌Cry9Ea6蛋白對美國白蛾的殺蟲機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。