摘要：目的構(gòu)建編碼腸道病毒71型(EV71)3D聚合酶基因的重組質(zhì)粒,表達(dá)和純化3D聚合酶并檢測(cè)其活性。方法將編碼3D聚合酶的基因片段克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析、TEV酶酶切、Ni-NTA柱親和純化后獲得高純度3D聚合酶蛋白,放射測(cè)量法是體外酶活力測(cè)定方法中較常見的一種方法,本研究通過測(cè)定插入poly(U)RNA放射性標(biāo)志UMP的量確定3D聚合酶的活性。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序鑒定pGEX-4T-3D重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,3D聚合酶基因片段大小為1 386 bp。與未誘導(dǎo)相比,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后帶有GST標(biāo)簽的3D聚合酶成功表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量約為79×10~3,TEV酶酶切掉GST標(biāo)簽后的相對(duì)分子質(zhì)量約為55×10~3。純化的3D聚合酶經(jīng)體外延伸反應(yīng)后跑變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳得知,3D聚合酶溶解液DMSO組相比于3D聚合酶強(qiáng)抑制劑EDTA組,在DMSO組中,可以觀察到強(qiáng)電泳條帶,表明放射性同位素標(biāo)志程度強(qiáng),表明反應(yīng)速率快,即3D聚合酶酶活較好。結(jié)論構(gòu)建了EV71 3D聚合酶基因重組質(zhì)粒,其表達(dá)產(chǎn)物3D聚合酶為以EV71 3D聚合酶為靶點(diǎn)的抗EV71藥物篩選奠定基礎(chǔ)。